1. RNA与转染试剂的比例较差
由于RNA序列、合成条件和荧光标志的不同，RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。
优化RNA浓度和转染试剂量(24well)
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| RNA工作浓度 | 25nM | 50nM | 100nM | 150nM | |
| 每孔RNA的量(pmol) | 0.17μg(12.5pmol) | 0.33μg(25pmol) | 0.67μg(50pmol) | 1μg(75pmol) | |
| 每孔转染试剂量 | 0.25μl | 0.5μl | 1μl | 1.5μl | |
2. 细胞密度差
将细胞密度调整到转染时，汇合度为20-40%。SiRNA细胞的成功转染会降低目标基因表达，但未成功转染的细胞不会受到影响。此时，转染效率和总细胞数量非常重要。当细胞数量较少时，转染效率较高。由于SiRNA沉默及时性的影响，QRT-PCR检测只能在感染后48小时进行，蛋白质检测只能在感染后48-72小时进行。如果铺装密度高，一方面细胞的感染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，在48小时或更长时间后，过密的细胞会影响细胞状态，从而影响实验结果。
3. RNA效率低
选择最佳RNA，并比较已知和高效的RNA。SiRNA的合成需要注意的是，必须选择高纯度的SiRNA。SiRNA的纯度直接关系到感染效率和沉默效率。SiRNA的工作浓度与SiRNA的设计、细胞类型和目标基因有关。建议对所有条件进行相关的预实验优化。
4. RNA酶污染
建议吸头、离心管、溶液等无RNA酶和内毒素的材料和实验设备。
5. 转染后培养时间不够
结果可在mRNA水平48小时后验证，蛋白质水平72小时后验证。SiRNA的沉默效果是及时的。在最佳时间观察时，会得到更明显的沉默效果。这个时间点的确定不能根据同一细胞感染DNA的经验来确定，因为一个是消耗MRNA，另一个是产生MRNA。对于转染性SIRNA，在核酸水平和转染后8-48小时，可以观察到MRNA水平的逐渐下降。一般来说，QRT-PCR检测在转染后48小时通常会得到漂亮的结果。
6. 培养基毒性
全培养基含有10-20%的血清。使用脂质体等转染试剂时，由于血清转染会将血清中的蛋白质带入细胞，导致细胞毒性，降低转染效率，因此无血清转染。Entranstertm只浓缩包裹核酸，不会将血清带入细胞，因此可能会有血清转染。同时，由于血清的存在，有利于细胞的状态维护，可以提高转染效率。
7. 细胞污染
建议彻底清洁所有细胞培养相关用品
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