高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备

一、试剂

CaCl₂ 溶液( 2mol/L )、完全培养基，DMEM 培养基、乙醇(或异丙醇) (70% )、胎牛血清( FBS )、HBS 溶液(2X)、HEPES (2.5mmol/L, pH 7.3)、OptiMEM  1 ％青霉素／链霉素( P/S )、OptiMEM , 无P/S、pCMVDΔR8.91 质粒、pUMVC 质粒、pVSV- G 质粒、喷雾瓶、293T 细胞、穿梭慢性病毒载体颗粒、胰蛋白酶EDTA ( 0.05%)

二、设备

小型台式离心机、生物安全柜、漂白剂( 14% )、细胞培养箱( 37 °C )、无菌锥底管( 15mL 和50mL )、培养皿( 150mm )、恒湿细胞培养箱(37℃，血细胞计数器， 5% CO²)、带无菌滤芯的冰和冰桶(sterile barrier ) 微量移液器的吸头( 20μL 、200μL 和l000μL)、PVDF (聚偏二氛乙烯)、 Durapore 过滤装置( l50mL, 0.45μm 与真空管、SW32 或SW28 转子、试管架、无菌试管(0.65ml)、SW32 或SW28 转子超速离心机( Beckman )、一次性超透明圆底管( 25mmX 89mm; Beckman)、UV 光源，涡旋仪

三、方法

转染用293T 细胞平板接种

1 将293T 细胞接种150毫米 平皿的20mL 在完全培养基中， 37 °C 、5%CO²每3个恒温细胞培养箱培养一次 或4 天1 : 10 传代细胞。
2 转染前1 天，弃完全培养基， 用l0 mL PBS 洗涤细胞， 弃PBS 5mL0.05.05后加入5mL0 ％胰蛋白酶－EDTA 。室温放置5 ~ l0min ，来回摇动平板电脑，直到细胞脱离板底。加入5mL 完全培养基中和胰蛋白酶，然后用力吹，使胰蛋白酶－EDTA 溶液击中板底，产生单细胞悬液。将细胞悬液转移到50毫升 锥底管中。
3 悬浮液中的细胞浓度是用血细胞计数器计算的。一个150毫米 平皿中293T 细胞汇合约为60 X 10⁶~80 X 10⁶个细胞。
4 将21 X 10⁶ 个293T 细胞接种于37 °C 预热的150mm 平皿中20mL 完全培养基。轻轻来回摇动平盘，使细胞均匀分布，然后将平盘放置在37个 °C 在细胞培养箱里过夜。准备5 一个平盘。准备多个平盘时， 计算150mm 平皿所需的细胞悬液体积，最终浓度为4.2 X 10⁶个细胞／mL 细胞悬液。每平皿加15mL 完全培养基，加5ml 细胞悬液。如上述细胞均匀分散。

慢性病毒载体和辅助颗粒共感染293T 细胞

5 第1 天， 转染前2~ 4h, 用20毫升代替所有平皿的培养基 新鲜完整的培养基， 37 °C预热。
6. 准备以下2 试管足以感染5 个150mm 平皿DNA 。使用带有无菌滤芯的吸头来降低污染风险。

i. 管1: 混合DNA （无菌15mL 锥底管中）

ii.管2: HBS 溶液（无菌5 0mL 锥底管中）

7 用70％乙醇完全喷洒涡旋仪，用纸巾擦拭，放入生物安全细胞培养柜中。
8 高速涡旋管2 的同时，在1 ~ 2min 内，逐滴地向管2 中加入管1 混合物。室温孵育20 ~ 30min 。
9. 加入1.56mL 步骤8 中间的转染溶液每150mm (步骤5)在平皿中 中制备） 。轻轻地来回摇动平盘，使细胞均匀分布，然后将平盘放回37°C 过夜孵化在细胞培养箱中。
10. 第2 每天早上，弃培养液，用15毫升 、37 °C DMEM预热 清洗细胞2 第二次。尽量去除洗涤液。

11 将37 °C 预热的含1% P/S 的15mL OptiMEM 加入细胞培养皿。然后将细胞培养皿放回37 °C 细胞培养箱。

收获慢病毒载体上清

12 第4 上午，将培养皿中的培养基全部转移到2 个50mL 锥底管内盖紧盖子，喷7 0％从生物安全柜中取出乙醇。

13. 4 ℃ 、500g 离心50mL 锥底管l0min， 弃细胞。
14 将上清液转移到150毫升 、0.45μm PVDF的孔径 与抽真空装置连接的过滤装置。收集病毒过滤液(约70ml ) ，冰上放置。
15 此时此刻，慢性病毒载体上的滴度应为10⁶ ~ 10⁸ 个转导单位( TU ) /mL , 这取决于载体和转入基因。如果滴度满足要求，则可将慢性病毒载体上的清液分装并储存在-8 0℃ 。否则，立即继续浓缩步骤。

超速离心浓缩漫病毒种子

16 打开SW32 桶，桶放在管架上， 盖子内侧朝上，以确保其完全暴露在紫外线下。在生物安全柜中使用紫外线照射桶和盖子10~ 20min, 或者使用70％用乙醇处理桶盖20 ~ 30min 。去除乙醇的风干桶和盖。
17 . 将2 个25mmX 89mm 在超离心管放置架上加满7 0％乙醇，处理20 ~ 30min 。
18 . 倒出7 0％乙醇。尽可能用连接抽真空装置的无菌巴斯德移液管去除乙醇。使用无菌PBS 洗涤离心管2 次。
19 将步骤14 得到的7 0mL SW322平均分布在过滤过的慢病毒上 将桶盖紧后，从生物安全柜中取出。将桶放在冰上10分钟 。此外，SW32(或SW28)将在浓缩慢病毒载体上清的前一天晚上进行 转子4 °C 放置。否则，超速离心机需要相当长的时间来冷却巨大的转子。
20 使用SW32 或SW28 4.转子，离心管 °C 下、28000r/min 离心75min 。
21 将筒子从转子中取出，放在冰上。70％乙醇喷桶，然后转移到生物安全柜。打开生物安全柜中的气缸，用干净的摄像头从气缸中取出离心管，将上清液倒入1 在一个瓶子里，加入1/6 体积14％处理lh的漂白剂 后丢弃。将超离心管倒置在纸巾上，用连接抽真空装置的无菌巴斯德移液管尽可能吸收管壁上的培养基，避免接触管的圆底。
22 使用200μL 带无菌滤芯吸头的微量移液器，加50 ~ 100μL OptiMEM （无P/S)到每个试管的圆底中心，室温下静置5 ~ 10min 。也可用50 ~ 100μL 的PBS 重悬慢病毒载体。吸头轻轻吹打重型慢性病毒载体病毒颗粒，避免气泡。另一种方法是将管道放在生物安全柜的冰上2h， 然后轻轻吹打。
慢性病毒载体颗粒是透明的， 管底很难辨认。但是小心翼翼的悬后， 与OptiMEMEM相比，慢性病毒载体的浓缩储备液 稍微混浊。
23 将慢性病毒悬液转移到0.65毫升 并将无菌管混合均匀。l0μL 分装，储存－80 °C 。