前段时间，一位微友在平台上咨询了细胞感染，并发表了一篇博客文章磷酸钙转染为何不稳定？磷酸钙转染为何不经济？我更感兴趣。在这里，我对这位微友的疑惑有了更全面的了解。在这里，我将与大家分享磷酸钙转染的原理和步骤，供交流和讨论。
磷酸钙是核酸-DNA 当共沉淀物的形式出现时，可以使 DNA 附着在细胞表面，有利于细胞吞咽和摄入核酸，或通过细胞膜脂相收缩时裂缝进入细胞。只有1%的DNA进入细胞～5%的DNA可以进入细胞核，其中不到1%的DNA可以进入细胞核 DNA 在细胞中进行稳定的表达，基因转导的频率约为10-4，该技术可用于任何DNA导入哺乳动物的临时表达或长期转化。这种方法通常用于壁细胞的转染。
- 试剂的配制
(1)2×HBS 1.63 g NaCl ； 1.19g Hepes； 0.023 g Na2 PO4 ·2H2 O； 加水至100 ml pH 7.1 过滤，4℃保存
(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌
(3)TE：0.1mmol/L EDTA，1mmol/L Tris-HCL PH 8.0
(4)G418(新霉素G418)液体:1g G418溶于1mmol/GL 在Hepes液中加入Hepes2 O至10ml过滤灭菌4℃保存。
(5)G418选择培养基:G418采用含有10%胎牛血清的DMEM培养液，G418浓度为200～ 800mg/L
注：首先对受体细胞进行预试验，浓度为10～最低浓度可在14天内杀死50%以上的细胞。
- 操作步骤
(1)DNA供体制备:DNA提取方法按前面介绍的方法提取，溶于TE，40mg/L。
（2）受体细胞的培养：在研究癌基因转移时，应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。例如，小鼠NIH3T3胚胎成纤维细胞系具有一定的自发转化倾向。一般来说，细胞在感染前一天接种，接种密度为2×104 /cm2 ,DMEM液含有10%胎牛血清，37℃、5%CO2 待细胞占50～当瓶底面积为70%时，用于转染试验。
(3)DNA-制备磷酸钙沉淀物
①40mg/L的DNA溶液由供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA制成，供体细胞DNA液200μ在l中加入带基因neo质粒DNA液(20mg//L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo1～使用2mg/L)。
②取500μl在硅化试管中加入上述DNA溶液，慢慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。
③然后立即混合，在室温下静置30分钟，待溶液轻微混浊后，用于感染受体细胞。
(4)感染受体细胞
①对数生长期将占据50个瓶底～70% 新鲜培养基每瓶5ml(25ml培养瓶)应在转染前4小时更换受体细胞。
②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，用含5ml培养液的细胞瓶摇匀。
③置37℃ 5% CO2 培养24小时或更长时间，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙晶粒。
④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。
⑤更换浓度 选用培养液筛选800mg/L的G418。同时，还有未转染的对照细胞。
⑥培养大约3～5天内，对照大部分细胞死亡，此时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3天～选择培养基每4天更换一次。
⑦ 2 一周后，与细胞死亡相比，抗药细胞克隆出现在感染的细胞瓶中。增大后，可建立转化细胞株并进一步鉴定。
