小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 作为原代培养细胞，其刺激增殖能力强、可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供各种刺激干细胞增殖的因素，另一方面保持干细胞未分化。虽然MEF 传代次数有限，但可早期冻结，持续复苏，长期使用。MEF 缺点是G418无法忍受 的筛选。替代方法是不断表达neo 抗性小鼠系或转基因系分离培养MEF 。利用各种转基因鼠培养的MEF 细胞也是研究各种基因功能的好工具。
（一）材料
12.5~14.5d 小鼠胚胎(3~6 只小鼠／二、培养皿（ 直径10cm)， DMEM 新生牛血清的10%， 15cm 或50cm 离心管(圆底)， PBS 配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA.02%消化液、手术刀、镊子、剪子等设备。
(二)操作步骤
1. 一般操作
(1) 用Hanks解剖培养皿中的鼠胚 溶液消洗。
(2) 去除四肢、大脑和内脏(肝脏) 。
(3) 使用无菌Hanks 溶液＋PBS 漂洗3 次。
(4) 在培养皿中，用手术切割。
(5) 将剪切组织移动到50毫升 在离心管中加入约10ml 消化液。
(6) 37°C摇育10min (在水浴或孵化器中)。
(7) 吸5ml 将上清液放入另一50毫升 在离心管中，加等体积含有10％DMEMEM新生牛血清 培养液中和胰蛋白酶。
(8) 再加入4ml 消化液到原离心管(含组织)，颠倒摇晃，10min 然后吸出5毫升 在另一个离心管中加入上清液5ml 含10% DMEMEM新生牛血清 培养液。
(9) 重复上一步5 二次左右，此时离心管内只有不可消化的软骨等。
(10) 离心50ml 加50毫升离心管 含10％DMEMEM新生牛血清 培养液。
(11) 取适量移至培养皿或培养瓶进行培养。
(12) 第二天换液，直到细胞长满(汇合) : 10 当它再生长到适当的密度时，它可以被冷冻和储存。
(13) 由于MEF细胞代数有限，因此在实验过程中应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。
2. 丝裂霉素处理或γ-射线处理 MEF用作饲养层 细胞还必须进行丝裂霉素或干射线处理，步骤如下。
（1） 丝裂霉素处理
- 冷冻MEF复苏 细胞(5×104 个/cm2，保证用时满一层，不留空间。
- MEF在汇合状态下 加入新配制的含10％新生牛血清，10μg/ml DMEM丝裂霉菌 培养液， 37 °C 、5% CO2培养箱培养2~3h 。
- 以PBS 几次彻底冲洗，胰蛋白酶消化，每分钟1万 转速离心5min，收集沉淀，悬浮新的培养液，调整浓度3×105g 个/ml。
- 将细胞接种到经明胶预处理的培养皿中。(明胶预处理: 0.1％明胶溶液浸泡2h， 取出多余的明胶，待自然干燥。)
(2)γ-射线处理
- MEF的汇合状态 细胞，以30~ 100Gy 的γ－射线处理。
- 消化胰蛋白酶，收集细胞，离心(每分钟1万 转， 10min )、计数，接种到明胶预处理培养皿中。Y-射线处理的细胞也可以是5×106 个／ml 浓度冻结。复苏后， 1 支冻存管可接种到4~5 块直径6cm 在培养皿中。
