免疫沉淀（IP）它是应用最广泛的免疫化学技术之一。免疫沉淀，然后是SDS-PAGE和免疫痕迹，通常用于确定蛋白质抗原的分子量，研究蛋白质之间的相互作用，确定特异性酶活性，监测蛋白质翻译后的修改，确定蛋白质的存在和数量。
在IP方法中，来自细胞或组织均匀浆液的蛋白质通过免疫复合物沉淀在适当的裂解缓冲液中，包括抗原（蛋白质）、第一抗体和蛋白质A-、G-或者是l-蔗糖或第二抗体琼脂糖。琼脂糖缀合物的选择取决于初级抗体的物种来源和相同类型。描述的方法是可比的，方法的选择取决于特异性抗原抗体系统。
试剂和设备
1.琼脂糖缀合物：固定在Sepharose上®CL-4B(产品编号P405880）或者G蛋白琼脂糖4B(产品编号)R394624）或者L蛋白琼脂糖(产品编号)P394623）A蛋白或抗体-琼脂糖缀合体(根据第一抗体的物种来源和同类型的第二抗体缀合物)
2.制备细胞或组织裂解物
3.免疫沉淀一级抗体和非相关抗体(阴性对照)
4.SDS-PAGE及免疫印迹试剂及设备
5.HNTG缓冲液：20mm HEPES缓冲液，pH 7.5(产品编号H109406），含有150mM NaCl（产品编号S301560）、0.1%（w/v）Triton X-100（产品编号T434565）和10%（w/v）甘油(产品编号G424796）
6.洗涤缓冲液(冷)：HNTG缓冲液或PBS pH 7.4(产品编号R355028），或其他缓冲液(RIPA缓冲液)根据所需的洗涤严格程度 产品编号 R488105）
7.是否有2-硫基乙醇(2)-ME（产品编号M301574））莱姆利样品缓冲液(例如1x、2x或3x）
8.微离心管
9.微型离心机和振动筛
免疫步骤
特异性抗原的免疫沉淀
注：除非另有说明，否则在冰上使用微离心管执行所有IP步骤。
琼脂糖缀合物用洗涤缓冲液洗涤两次，室温下12000xg离心10秒，上清液丢弃。
注：如果琼脂糖是粉末，则用去离子H2O重建并膨胀5分钟。
琼脂糖缀合物在洗涤缓冲液(50%悬浮液)中重新悬浮。
继续根据需要使用方法A或方法B。
方法A
1.琼脂糖缀合物在微量离心管中分为50-1000µL（约25-50µ等分试样L琼脂糖/床体积)。
2.在每根试管中加入10个µ适当稀释初级抗体。
3.在室温下培养15-60分钟，在适当的摇壶上轻轻混合样品。
4.在4°C以3000xg离心2分钟，丢弃上清液。
5.每个样品用1ml洗涤缓冲液洗涤，4°C以3000xg离心2分钟，重复这一步至少两次。
6.在每根试管中加入0.1-1.0 细胞裂解物ml。
7.在4°在C下培养90分钟到过夜，在合适的摇壶上轻轻混合样品。
8.通过在4°C以3000xg离心2分钟收集免疫沉淀复合物，丢弃上清液。
9.用1 ML洗涤缓冲液洗涤颗粒，4°C以3000xg离心2分钟。重复这一步至少3次。
方法B
1.向细胞裂解物样品(0.1-1.00 mL）中加入10µL适当稀释抗体(参考产品规范)。
2.在4°在C下培养90分钟到过夜，在合适的摇壶上轻轻混合样品。
3.加入50-100µL琼脂糖合物悬浮液(约25-50µL琼脂糖/床体积)。
4.在4°在C下培养15-60分钟，用摇壶轻轻混合样品。
5.通过在4°C以3000xg离心2分钟收集免疫沉淀复合物，丢弃上清液。
6.通过重悬浮和4°C离心3000xg2分钟，用1ml洗涤缓冲液洗涤颗粒。重复此步骤至少3次。
SDS-制备PAGE
1.将每颗粒再次悬浮在25-1000µL莱姆利样品缓冲液最终浓度为1x样品缓冲液，样品为95°加热C下5分钟。
2.室温下以12000xg离心30秒。收集上清液(IP样品)。如有必要，IP样品可储存在-70°样品缓冲液中的C。
3.在SDS-已知浓度的样品和MW标准产品(聚丙烯酰胺凝胶的适当百分比取决于蛋白质的分子大小)在PAGE上运行。
4.转移到硝化纤维上进行免疫印记。
免疫沉淀（IP）常见问题及答案
1. 一般免染抗体能否作为免疫沉淀试验？
答:抗体的性质对免疫沉淀实验有很大的影响。抗体与抗原和Protein不同 G或Protein A的组合能力也有所不同。因此，一般的无染抗体可能不能用于IP反应。一般来说，多抗体是沉淀反应的最佳选择。此外，纯化单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。
2. 为什么在溶解抗原的缓冲液中加入一定量的蛋白酶抑制剂？
答：活性细胞裂解的样品通常含有一定量的蛋白酶。为了防止蛋白质的分解和修饰，溶解抗原的缓冲液必须在低温下添加每个抑制剂和实验。
3. 制备溶解抗原缓冲液需要注意什么？
答：大多数抗原是由细胞组成的蛋白质，特别是骨架蛋白，缓冲液必须溶解。因此，虽然它可能会影响一些抗原抗体的组合，但必须使用含有强表面活性剂的缓冲液。另一方面，如果细胞用弱表面活性剂溶解，细胞蛋白就不能完全溶解。即使溶解也会产生与其他蛋白质结合的结果，抗原决定了家庭关闭，影响抗体的结合。
4. 抗体与缓冲液的比例应如何掌握免疫沉淀实验？
答:在每次沉淀实验之前，考虑抗体/缓冲液的比例非常重要。如果抗体太少，抗原就无法检测出来。如果抗体太多，就无法沉降在beads上，残留在上清；如果缓冲剂太少，抗原就无法溶解，如果抗原太多，抗原就会被稀释。具体比例视具体情况而定。
5.如何准备免疫沉淀的细胞裂解液？
答:细胞裂解液的适当选择取决于蛋白质的特性。TritonX-NP40是一种非离子界面活性剂，作用温和；DOC(sodium de-oxycholate)，SDS是离子强活性剂。因此，在制备裂解液时，需要优化去污剂的种类、浓度和盐浓度。请注意，如果忘记添加TritonX-100，只添加DOC或SDS，抗体可能会完全失去活性。
参考文献
[1] Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. Laboratory Press New York: Cold Spring Harbor.
