酶是一种非常强大的催化剂，它使用复杂的活性点来处理化学转化。酶强大的加速反应能力和无与伦比的选择性使它们成为可持续制造过程中有吸引力的催化剂。生物催化领域已发展到绿色和高效化学工业发展的关键授权技术阶段。几种主要的方法创新支持了快速进展，包括：
1) DNA合成和测序服务快速、准确、低成本；
2) 开发先进的生物信息学工具和计算建模方法；
3) 以及日益复杂的高通量结构和生化酶表征的实验工作流程。
然而，由于生物系统本身的复杂性和天然酶对非天然产品的适用性较差，生物催化技术的发展往往周期长，投资巨大，严重限制了生物催化技术的推广。在实际应用中，天然酶通常需要蛋白质工程来优化其特性。近年来，出现了高通量蛋白质工程策略，最明显的是定向进化，用于开发生物催化剂，在商业可行的工艺条件下有效地处理非天然底物，有效地运行。
催化生物体
生物体的催化是在活宿主细胞中进行的，通过各种酶的有机结合，根据代谢途径逐步进行催化反应。代谢工程是为了更有效地获得产品而设计和构建这些代谢途径。由于活细胞中的生物转化不需要补充外部辅助因素或蛋白质纯化，体内催化已成为一种具有高成本效益的方法。
体内发酵代谢工程代谢工程利用分子生物技术或DNA重组技术等基因工程，通过控制细胞中的酶、运输和调节功能，改变或构建细胞的活动和代谢途径，从而提高所需产品的产量或获得新产品[1]。基于对细胞功能的分析，成功的代谢工程设计了改进的菌株，然后通过基因工程构建。随着对代谢工程的研究越来越多，许多人以自己的理解对代谢工程进行了分类[1、2]，其中Nielsen J.根据不同的方法和目的细分生物代谢工程[3]：1、将异源基因插入宿主生产异源蛋白；2、扩大微生物对底物的应用范围，以便更有效地利用原料；3、通过基因洗牌或蛋白质定向进化等策略生产新的代谢途径，从而提高生成率；4、通过插入其它生物的代谢途径，使特定生物体具有同时降解多种化合物的能力；5、对细胞生理学进行工程设计，以改善细胞的物理化学性质和形态；6、设计代谢方法，以避免副产物对细胞的负面影响，从而消除或减少副产物的产生；7、通过增加生物合成途径的活性，增加产量和生产力。
体外催化的生物
生物体外催化可以通过实际生产条件下多酶的性能进行工程改造，多酶参与级联反应简化工艺流程，减少部分中间产物或副产物的产生，避免副产物对细胞的毒性，中间产物的分离，提高收率和纯度，节省生产成本[4]。
酶催化级联反应系统有多种类型，目前最常见的是分为以下四类[5]：(A)线性级联反应； (B)正交级联反应； (C)平行级联反应； (D)循环级联反应。在实际的级联反应中，通常不仅使用一种反应类型，而且使用多种组合。氧化还原酶和转氨酶是最常用的酶之一。
A. 在酶催化成一个或多个中间物后，将单个底物转化为单个最终产物的过程称为线性级联反应，这是四个级联系统中最简单、最直观的；
B. 正交级联反应的特点是酶将底物转化为产物，然后在辅助底物存在时参与另一种酶反应，以便辅助因子或辅助底物再生，或可以去除产生的副产物，使反应朝正方向进行。最经典的正交级联是基还原酶偶联脱氢酶，实现辅酶再生；
C. 两种或两种以上的底物通过不同的生物催化反应系统转化为两种以上的产物，但共用同一套辅酶或辅底物再生系统的过程称为平行级联；
D. 循环级联反应是指多个底物可以选择性地转化为中间物，然后转化为所需的化合物或原材料进行重复循环反应，循环过程中所需的化合物不断积累。
体内与体外的比较和优缺点分析
体内生物转化
优势：
1、辅酶循环(如ATP)可以在体内实现，NADPH, SAM等)，无需额外补充；
2、体内环境稳定，不易影响相关酶的活性和稳定性。
劣势：
1、细胞内合成的活性代谢化合物会限制其积累浓度(如丙酮酸)，即容易转化为其他物质，导致最终产量低；
2、对细胞有毒的化合物不易合成；
3、动力学不易控制和改造代谢通道；
4、产品浓度一般较低，分离纯化复杂；
产物生产和细胞生存对物质的竞争需要平衡。
体外酶级联
优势：
1、减少反应步骤，降低成本；
2、反应系统可根据产品的物理化学特性和分离工艺要求灵活选择，更容易优化系统工艺，达到较高的时空产量和提取收率。
3、选择合适的大宗产品作为起始原料，可以达到最高的原子经济性(100%)。
劣势：
1、当需要使用ATP、NADPH等昂贵的辅酶时，应同时考虑辅酶循环系统的构建；
2、体外部分酶稳定性差，大规模稳定生产困难；
3、体外多酶的协作往往不如体内有序高效。
生物酶催化技术在药物合成中的应用
在解决制药行业环境问题的过程中，氧化酶、还原酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转氨酶等多种生物催化剂可用于药物和药物中间体的合成。本文以最常见的氧化还原反应为例，简要介绍了生物酶催化技术在药物合成中的应用。
氧化反应
目前，生物氧化反应在制药行业得到了广泛的应用，人们正在探索氧化酶在生物催化中的应用。例如，丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂telaprevir、boceprevir和质子泵抑制剂埃索美拉唑在工业生产中使用氧化酶。另一个例子是，植物雌激素松脂醇可以在各种疾病的过程中保护身体，所以制药界对它有很多研究。有报道称使用青霉菌（Penicillium simplicissimum）香草醇氧化酶和细菌漆酶，以低价丁子酚为原料，两步一锅合成松脂醇。在优化条件下，松脂醇的合成可达1.6g半制备规模/L(图2)。
图2. 通过串联反应，将香草醇氧化酶和细菌漆酶合成松脂醇
还原反应
生物酶催化剂的使用对碱官能团的区域选择性和三维选择性有很好的影响，特别是在恢复合成手药中间体的过程中。例如，新的微生物菌株与环境分离，具有良好的碱还原活性和所需的生化特性，包括热稳定性和对有机溶剂的耐受性。
光学纯叔丁基6-氰基-(3R、5R)-二羟基己酸酯是立普妥(阿托伐他汀钙)的关键手性前体，由6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯通过还原酶还原而成。据报道，乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）一种新型的基还原酶KlAKR，能不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(图3)。利用半理性设计策略提高酶的活性，通过两轮基于同源建模和分子对接的位点饱和突变筛选得到的突变体Y295W/W296L，催化效率是野生KLAKR的11.25倍。
图3. 还原酶KLAKR催化的还原反应
通过筛选新的微生物或基因组挖掘来识别新的基因，然后通过理性设计、非理性设计、高通量筛选平台等强大的酶工程工具来优化和筛选这些生物酶，并不断开发新的酶催化剂。不仅开发新的酶，而且找到一个充分发挥其活性的环境，并应用于适当的反应。
生物酶的研究前景
在过去的十年里，酶设计和工程领域取得了巨大的进展。自下而上或自始至终设计的酶设计，即在蛋白质宿主中创建一个新的催化中心，可以为未来生物催化剂交付的速度和范围提供一般的解决方案。如果设计要达到或超过更成熟的自上而下生物催化剂开发方法的实际效用水平，那么该研究领域现在必须解决两个核心挑战：
首先，设计更接近自然系统的高活性酶。目前，为了识别一些显示所需活性的设计，并进行广泛的进化优化，以弥补与天然酶的效率差距，即使对于相对简单的转换，也必须进行大量的设计和实验测试。在多步反应中，设计挑战被放大，需要精心规划的构象调整，以准确识别各种化学状态。酶设计的未来成功对于活性位点预组织和构象动力学之间的平衡至关重要。
其次，必须扩大从头酶可以实现的化学范围，并为大规模实施的有价值的化学过程开发催化剂。在这里，有机化学家和蛋白质设计师之间更广泛的合作对于确定合适的活性位置来转化新的目标尤为有价值。新功能氨基酸通过工程细胞翻译引入蛋白质，可以大大扩大化学物质的范围。这些氨基酸可用于调节金属离子辅因子的催化作用或作为小分子有机催化剂的基因编码替代品。未来，酶设计师和工程师将继续通过开发日益复杂的转化催化剂来促进该领域的发展。
参考文献
1.Bailey, J. (1991). Toward a science of metabolic engineering. Science, 252(5013), 1668–1675. doi:10.1126/science.2047876
2.Cameron, D. C., & Tong, I.-T. (1993). Cellular and metabolic engineering. Applied Biochemistry and Biotechnology, 38(1-2), 105–140. doi:10.1007/bf02916416
3.Nielsen, J. (2001). Metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology, 55(3), 263–283. doi:10.1007/s002530000511
4.李国4.生物催化级联反应制备丙酮酸和L-酪氨酸衍生物[D].浙江大学,2020.DOI:10.27461/d.cnki.gzjdx.2020.003762.
5.Ricca, E., Brucher, B., & Schrittwieser, J. H. (2011). Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Advanced Synthesis & Catalysis, 353(13), 2239–2262. doi:10.1002/adsc.201100256
