揭秘RNAi，缔造实验神话

用siRNAtransient transfection不稳定，几代细胞后症状就会消失，所以转染几天(1-3)后要立即提取蛋白质进行分析。
用质粒中的shRNA转染，如果质粒中含有抗生素位点，可以筛选获得更稳定的细胞株系，但需要很长时间
感染病毒中的shRNA（infection），细胞株系可以在抗生素筛选后获得非常稳定的细胞。

瞬时RNAi
短期感染是一种常见的简单生物手段，可以通过非病毒感染将外源性SiRNA或能编码SiRNA的质粒引入细胞。细胞通常在细胞质膜表面有一个短孔或一个“孔”，这些特殊的孔结可以使基因物质通过细胞膜进入细胞质。在转染过程中，基因物质可以通过磷酸钙沉淀粘附在细胞膜表面，形成极小的磷酸钙复合物，并通过吞咽加速进入细胞质。或者脂质体含有物体可以通过带正电荷的阳离子脂质体形成，然后通过内吞进入细胞质。

然而，这些转染技术产生的沉默持续时间较短，因为诱导的SiRNA不能自行复制，细胞分化会被稀释或降解。由于不能插入核内基因组，转染的外源DNA通常会在细胞有丝分裂过程中丢失。一旦转染细胞中的SiRNA消失，靶基因功能就会恢复到转染前的水平。利用转染技术产生基因沉默通常是48－高沉默率只能在72小时内达到，只能根据不同的转染效率保持24小时－９６小时。因此，SiRNA转染可以作为短期分析基因功能的有效工具，方便快速验证SiRNA对靶基因的干扰效率。目前，由于SiRNA转染技术易于制备，可随时使用，操作时间短，主要用于短期基因沉默。

长久RNAi

由于表型变化通常与基因型变化在时间上不同步，许多分析试验需要对靶基因的长期沉默。SiRNA转染直接产生的沉默不能用于长期实验研究，而合成SiRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率，不能广泛应用于其他类型的细胞。载体质粒的使用也受到细胞系统的限制。例如，原代细胞不能转染为长期培养研究。

长期的基因沉默特别需要发展一种长期稳定的细胞系统，这就要求转染的外源基因能够长期留在宿主细胞基因组或其子代细胞基因组中。

病毒介导SiRNA载体具有病毒感染效率高的特点，是原代细胞等难转染细胞的良好选择。为了准确测量SiRNA对细胞靶基因的沉默效率，必须能够感染更多的细胞。否则，如果转染细胞数量不足，则使用RT-PCR或Western 当analysis进行分析时，背景条件下的非转染细胞会干扰我们对转染细胞的分析结果。

目前，发卡siRNA病毒载体有以下几种表达，包括：1.逆转录病毒载体， 这是一个更有用的载体，它可以将siRNA表达框集成到分化的细胞基因组中，并在抗生素选择条件下保持稳定和长期的hsRNA表达。2.慢性病毒载体扩大了宿主细胞的类型，包括一些未分化的细胞和最终分化的细胞。通过扩展，成功的细胞基因组将永远包含shRNA表达框，并能稳定地表达shRNA，产生持久的基因沉默效果。3. 腺病毒载体，也是一种常见的分整合病毒，它能感染分化和未分化的细胞，但只能以游离体的形式存在于细胞中。

英格恩生物公司新开发的纳米聚合物高效转染试剂包括体内转染试剂、体外转染试剂，包括RNA、DNA采用纳米技术合成，是超越脂质体的最新低毒高效转染试剂。大大提高了转染效率，将体内转染时间缩短到3天，可谓转染界的神话！