如何评估Real-time qPCR定量检测？

一、Real-time QPCR定量方法

可分为绝对定量和相对定量。

绝对定量是用一系列已知浓度的标准产品制作标准曲线。在相同条件下，目标基因测量的荧光信号量与标准曲线进行比较，以获得目标基因的数量。该标准产品可以是纯质粒DNA、体外转录RNA或体外合成SSDNA。

相对定量可分为比较CT法和其他相对方法。比较CT是指通过与内参基因CT值的差异来计算基因表达差异，也称为 2-∆∆Ct 。

1. 绝对定量

Y=-3.432X 34.638;R2= 0.995, E=95%，可以进行数据分析。 若样品未知   Ct=25， 代入方程： 25=-3.432X 34.638, 所以： X=2.8 Copies=10^2.8

2. 2-∆∆Ct定量

3. 其它定量方法

二、 影响CT值的关键因素

1.模板浓度

决定CT的主要因素是模板浓度。将CT控制在适当的范围内，使CT在15-35之间。

2.反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受到环境因素的影响，如溶液的pH值和盐浓度。

3.PCR反应的效率

在PCR扩展效率低的情况下，可能会产生不同斜率的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合物性能和样品质量。一般来说，反应效率在90-110%之间是可以接受的。

如何评估实时定量PCR反应的效果

1. PCR扩展效率：为了正确评估PCR扩展效率，至少需要平行重复3次，至少需要5个数量级倍数（5） logs)连续梯度稀释模板浓度。
2. R2值：评估PCR效率的另一个关键参数是相关系数R2，这是一个统计学术语，解释了两个值之间的相关性。如果R2等于1，您可以使用Y值（Ct）准确预测X值(量)。如果R2等于0，则无法通过Y值预测X值。当R2值大于0.99时，两个值之间的相关可信度非常好。
3. 精确度: 标准偏差（standard deviation，平方根偏差)是最常用的精确测量方法。若许多数据点接近平均值，则标准偏差较小；若许多数据点远离平均值，则标准偏差较大。事实上，产生足够多重复次数的数据组会形成一般的正态分布。这通常可以通过经典的中心极限理论来证明，独立分布随机变量在无限多时往往是正态分布。若PCR反应效率为100%，则两倍稀释点之间的平均CT间隔应为1个CT值。稀释浓度为99.7%，标准偏差必须小于0.167。标准偏差越大，分辨两倍稀释的能力越低。标准偏差必须小于等于0.250，才能在95%以上的情况下区分两倍稀释。

4.灵敏度:无论CT的绝对值是多少，任何能有效扩展和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时，另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能根据普通情况来预测。相反，它将遵循泊松分布，即大量平行重复。平均来说，它应该包含一个复制的起始模板。事实上，大约37%不含复制品，只有大约37%含有一个复制品，大约18%实际上含有两个复制品。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须进行大量的平行重复实验，以提供统计显著性，克服泊松分布的限制。

荧光PCR结果评价标准

除这些因素外，还必须对适当的实验对照进行评估和验证(如无模板对照、无模板对照、无模板对照等) 反转录酶对照等。)以及模板质量。