(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；(2)用于基因组学和细胞信号传输通道分析；(3)用于药物靶点筛选和疾病治疗。
实验方法原理：
大多数SiRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)其中一个，操纵一个小发夹RNA(short hairpinRNA, shRNA)哺乳动物细胞中的表达。这三种启动子包括熟悉的人源和鼠源的U6启动子和H1启动子。RNA之所以被使用 pol III启动子是因为它能在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，并且通过添加一串(3到6个)U来终止转录。要使用此类载体，需要订购DNA单链、退火、克隆两段编码短发夹RNA序列到相应载体的pol III 启动子下游。因为涉及到克隆 ，这个过程需要几周甚至几个月，也需要测序，以确保克隆的顺序是正确的。
实验材料:
目的基因
试剂、试剂盒：
LB培养基
仪器、耗材：
离心管、离心机、水浴锅、漩涡振荡器等
实验步骤：
一、确定目的基因
- 检索文献获取有效的靶点序列(验证)。
- NCBI查阅：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
- 搜索引擎辅助：http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com。
二 、设计SiRNA靶序列
制备siRNA SiRNA序列需要单独设计。研究发现，对哺乳动物细胞最有效的SiRNAS是21-23个碱基，3端有两个突出碱基的双链RNA；对于非哺乳动物来说，长片段DSRNA更有效。SiRNA的序列专一性要求非常严格，与靶MRNA的碱基错配会显著削弱基因沉默。
- 选择SiRNA靶点
从转录AUG开始，搜索下游AA序列，记录每个AA 三端相邻的19个核苷酸作为候选人的SiRNA靶点。研究结果表明，GC含量在30%-50%左右的SiRNA比GC含量高的SiRNA更有效。Tuschl等建议在设计sirna时，不要针对5‘和3’端的非编码区域（untranslated regions,UTRs），原因是这些地方有丰富的蛋白质组合区域，这些UTR组合蛋白或翻译初始复合物可能会影响SiRNP核酸内切酶组合MRNA，从而影响SiRNA的效果。
- 序列同源性分析
将潜在的序列与相应的基因组数据库(人或小鼠、大鼠等)进行比较，排除与其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)选择合适的目标序列进行合成。并非所有合格的SiRNA都同样有效。原因尚不清楚，这可能是位置效应的结果。因此，对于目标基因，SiRNA通常需要选择3-5个目标点进行设计。
一般来说，每个目标序列设计3-4对sirnas，选择最有效的后续研究。
- 阴性对照的设计
一个完整的SiRNA实验应该有阴性对照。作为阴性对照，SiRNA应该与选定的SiRNA序列相同，但与MRNA没有明显的同源性。通常的方法是打乱所选SiRNA中的碱基序列。当然，我们也应该确保它与其他基因没有同源性。
三、表达载体的选择
- 化学合成和体外转录方法是在获得体外SIRNA后导入细胞，但这两种方法主要有两个不可克服的缺点：SIRNA进入细胞后容易降解；进入细胞SIRNA的RNA效应持续时间短。鉴于这种情况，SIRNA在质粒和病毒载体介导中的表达。该方法的基本思路是将SiRNA对应的DNA双链模板序列克隆到载体RNA聚合酶II的启动子中，从而在体内表达所需的SiRNA分子。这种方法的总体优点是不需要直接操作RNA，可以达到长期的基因沉默效果。
- 大多数通过质粒表达siRNAS的Poll III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因是启动子总是在离启动子的固定距离转录合成RNA，遇到4-5个连续U就终止，非常准确。有Pol的时候 III 当启动子和shRNA模板序列的质粒感染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能降低特定基因的表达，抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点是，SiRNA载体可以更长时间地抑制目的基因表达，通过SiRNA表达质粒的选择标记。当然，另一点是，与其他合成方法相比，质粒可以复制和扩展，这可以显著降低制备SiRNA的成本。
- 具有抗生素标记的SiRNA表达载体可用于长期抑制研究。通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达几周甚至更长时间。同时，RNAi-Ready表达载体也可以与逆转录病毒和腺病毒表达系统集成（BD Knockout RNAi Systems），大大提高了SiRNA表达载体对宿主细胞的感染，彻底克服了部分细胞感染效率低下的障碍，实现了哺乳动物细胞SiRNAS的瞬时表达和稳定表 理想的工具。
四、合成模板
- 合成编码 shRNADNA 模板的两个单链与RNA相连 PolyII聚合酶转录中止点，两端分别设计 BamH I 和 Hind III 酶切位点可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间。
- 95℃，5 min，缓慢退火， DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。
五、连接与转化
- 将100 μ感觉状细胞在冰上解冻。
- 取5 μl将产品连接到感觉细胞中，轻轻旋转几次，将内容物混合，在冰上放置30分钟。
- 将管道放入预加热至42℃的水浴中，加热90秒。将管道快速转移到冰浴中，冷却细胞1~2分钟。
- 每管中加700 μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，复苏。
- 室温4 000 rpm离心5分钟，弃去上清后，剩下100 μL培养基重悬细胞，并将其涂抹在含有抗性的LB琼脂平板表面。注：细胞用量应根据连接效率和感觉状细胞效率进行调整。
- 将平板放置在室温下，直到液体被吸收。
- 倒置平盘，37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
六、PCR鉴定和测序鉴定
DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，插入编码SHRNA，扩展片段在100-200bp之间。
注意事项：
- 从转录本（mRNA）AUG起始密码开始，寻找“AA作为潜在的SiRNA靶点，第二连序列，并写下其3端的19个碱基序列。研究结果表明，GC含量约为30%-50%的SiRNA比GC含量高的SiRNA更有效。
Tuschl等建议在设计sirna时，不要针对5‘和3’端的非编码区域（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的蛋白质组合区域，这些UTR组合蛋白或翻译初始复合物可能会影响SiRNP核酸内切酶组合MRNA，从而影响SiRNA的效果。
- 将潜在的序列与相应的基因组数据库（人、鼠标、鼠标等）进行比较，排除与其他编码序列/EST同源的序列。例如，使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
- 选择合适的目标序列进行合成。一个基因通常需要设计多个目标序列的SiRNA，以找到最有效的SiRNA序列。
- 一个完整的SiRNA实验应该有负对照。作为负对照，SiRNA应该与选定的SiRNA序列相同，但与MRNA没有明显的同源性。通常的做法是打乱所选的SiRNA序列，并检查结果，以确保它与其他基因没有同源性。
如果计划合成SiRNA，可以直接提供以AA为主的21个碱基序列，厂家会合成一对互补序列。需要注意的是，合成的SiRNA通常以3‘DTDT结束，如果要UU结束，通常需要特别说明。结果表明，UU结束与DTDT结束的SiRNA在效果上没有区别。因为这个突出端不需要补充靶序列。
