DEAE－葡聚糖介导的转染：高效率的转染方法

DEAE －葡聚糖介导的转染与磷酸钙共沉淀介导的转染有三个重要区别。首先，该方法用于克隆基因的瞬时表达，而不是细胞的稳定转化(Gluzman 1981 ) 。第二种方法是BSC-1 、CV- 1 和COS 细胞系非常有效，但对许多其他类型的细胞转染效果并不理想。第三， DEAE－DNA被葡聚糖转染 用量少于磷酸钙共沉淀转染。采用0.1 ~ 1.0μg DNA超螺旋质粒 转染10⁵ 猿细胞可以达到最高的转染效率和更多的DNA （大于2~3 μg ) 可能会有抑制作用。磷酸钙介导的转染需要高浓度的DNA 相反，促进共沉淀的形成，DEAE－葡聚糖转染法很少用于运输DNA 。

试剂

细胞生长培养基(完全培养基和无血清培养基)

二磷酸氯喹 (100mmol//U） <R>

DEAE－葡聚糖( 50mg/mL ) <R>

DEAE－葡聚糖转染试剂盒

哺乳动物细胞指数生长

磷酸盐缓冲液( PBS ) <A>

质粒DNA

Tris含有葡萄糖 盐缓冲液（TBS -D ) <R>

设备

组织培养皿( 60mm 或35mm )

方法

该方法生长在60毫米以上 或35mm 培养皿的细胞设计。如果使用其他多孔板、细胞瓶或不同直径的培养皿，细胞密度和试剂体积应按相应比例进行调整

1. 转染前24h , 收集指数通过胰酶消化生长的细胞，按10计算⁵细胞／培养皿的密度接种为60mm 组织培养皿(或5) X 10⁴细胞／35mm 培养皿)。加入5mL。 （35mm 培养皿为3mL ) 培养基的完全生长， 于含5 %~ 7% CO₂ 的37°C 湿润保温箱培养200 ~ 24h 。
2. 将0.1 ~ 4μg DNA超螺旋或环状颗粒 与lmg/mL 溶于TBS-D 的DEAE－混合葡聚糖，制备DNA/ DEAE－葡聚糖／TBS -D 溶液。
3. 用预热(37℃)吸出细胞培养皿中的培养基 PBS 两次洗涤细胞，两次预热TBS-D 洗涤一次。
4. 添加DNA//DEAE－葡聚糖/TBS-D 溶液(250μL/60 mm 培养皿， 150μL/35mm 培养皿） 。轻摇培养皿，使溶液均匀地覆盖单层细胞。将细胞放回保温箱培养300 ~ 90min (培养时间取决于每批细胞对DNA///DEAE-葡聚糖／TBS-D 溶液的敏感性)，每隔15次 ~ 20min, 将培养皿从温箱中取出，轻轻摇晃，在显微镜下检测细胞形态。若细胞仍牢固附着在基质上，则继续培养。当细胞开始皱缩变圆时，停止孵化。

5 . 吸DNA///DEAE－葡聚糖／TBS-D 预热的TBS溶液，预热的TBS溶液 -D 温和地清洗细胞一次，然后使用预热的PBS 洗涤一次，注意不要吸收转染细胞。

1. 加入5mL （每60mm 培养皿)或3mL （每35mm 含血清和氯喹的培养皿(最终浓度为l00μmol/L ) 将细胞放在含有5%的培养基中 ~ 7% CO₂ 的37°C 在湿润保温箱中培养3 ~ 5h 。
2. 吸出培养基，用无血清培养基洗涤细胞3 次数。在细胞中加入5mL （每60mm 培养皿)或3mL （每35mm 培养皿)含血清培养基，含5%~7% C0₂ 的37°C 在湿润保温箱中培养36~60h， 然后对转染DNA进行分析 瞬时表达。
3. DNA进入转染细胞进行分析 转染后立即表达情况36 ~ 60h 收获细胞。RNA 或DNA ；放射性免疫测定、免疫印记、免疫沉淀，或通过检测细胞提取物的酶活性来分析新合成的蛋白质。