乳酸脱氢酶催化的可逆反应
细胞毒性测定的常用方法是测量受损细胞释放的细胞浆酶的活性。乳酸脱氢酶( LDH ) 它是一种稳定的细胞浆酶，存在于所有细胞中。5存在于不同类型的组织中 不同的乳酸脱氢酶异构体在数量、特异性和酶动力学方面存在差异。然而，所有不同的酶异构都催化相同的丙酮酸和乳酸相互转化，并伴有NADH 氧化成NAD 反应(图1) 。当质膜受损时， LDH 在细胞培养上清中迅速释放， 这是细胞凋亡、坏死和其他形式损伤的重要特征。在将乳酸转化为丙酮酸过程中产生的NADH , 将偶联反应中的另一种化合物还原为易于定量的产物，从而简单地定量LDH 活性。该方案测量492nm 反映黄色四唑盐INT的吸光度 被NADH 还原为红色水溶性甲类( formazan-class) 染料的情况。LDH在培养系统中的数量和数量 数量成正比，相应地， 与死细胞或受损细胞的数量成正比。
试剂
已转染的哺乳动物细胞
这种方法必须重复三次。LDH 为了估计LDH，需要留出一组未经毒性试剂处理的细胞孔 的总量。
LDH 底物溶液的检测
LDH 标准(可选)
裂解液[9% (V/V) Triton X-100 ，用于测量细胞总LDH]
终止液［含50％ 二甲基甲酰胺( DMF ) 和2 0% SDS , pH 4.7]
lmol/可用lmol/可用L 当用于含酚红的培养基时，盐酸可以终止反应SDS 由于能中和背景吸附，溶液效果更好。
设备
微量滴定板分光光度计
96 孔板，标准平底
96 孔板， V 形底或圆底
组织培养皿(90mm) )
方法
优化靶细胞数(总LDH 释放测定）
不同类型的靶细胞（YAC-1 、K562 、Daudi等。)含有LDH 因此，需要使用实验所需类型的细胞进行预实验，以确定最合适的目标细胞数量，以确保足够的信噪比。
- 制备靶细胞稀释液(0细胞／ 100μL 、5000 细胞／100μL 、10000 细胞／ 100μL 和20000 细胞／ 100μL), 向V 形底或圆底96 板的每个孔加1000μL 。做三个重复。
- 向每孔加入15μL 裂解液，培养板250g 离心4min 。
- 转移50μL 上清至96 孔平底酶联板。
- 加入50个培养基μL LDH 检测底物。用锡箔覆盖板材或装入不透明的小盒子以避光， 37°C 孵育15 ~ 30min 。
- 加入100μL 终止液。
- 确保孔内无气泡。添加终止液lh 测量内490nm 吸光度在690nm处。 从主波长测量值测量背景吸光度( 490nm ) 中减值。
- 对于吸光度值至少是培养基对照背景吸光度的两倍的细胞，测量其细胞密度。
- （可选）向50μL 不同的LDH 标准中加入50μL 检测底物。孵化15min， 然后同上测量吸光度。将待测样品的酶活性与标准曲线进行比较。
细胞毒性检测
9.转移50μL 上清至96的细胞培养 孔板中。若为悬浮培养的细胞，则先将细胞250g离心4min， 然后移取50μL 上清。
10 . 加入50个培养基 μL LDH 检测底物。用锡箔覆盖板材或装入不透明的小盒子以避光， 37°C 孵育15 ~ 30min 。
- 加入l00μL 终止液。
12 . 确保孔内无气泡。添加终止液lh 测量内490nm 吸光度。690nm 从主波长测量背景吸光度( 490nm ) 中减值。
13 . 细胞死亡百分比(细胞毒性百分比)用以下等式计算确定：
细胞毒性（％） ＝实验组LDH释放量( OD490)/最大LDH释放量（OD490)
- （ 可选）向50μL 不同的LDH 标准中加入50 μL 检测底物。孵化15min , 然后同上测量吸光度。将待测样品的酶活性与标准曲线进行比较。
