选择一个一抗
抗体是一种与目标蛋白质直接结合的抗体，其可变抗体区域可以识别蛋白质的表面。在选择抗体时，应考虑以下几点：
抗体克隆及制造方法
克隆性取决于抗体是来自不同B细胞(多克隆抗体)或来自母克隆的同一B细胞(单克隆抗体)。这些抗体有不同的优点和局限性。
综上所述，多克隆抗体由异质抗体混合物组成，每种抗体都能识别特定抗原的不同表位。多克隆抗体可以在相关应用中产生针对目标抗原的强信号，而不是单个表位。但多克隆抗体供应有限，批次差异大，交叉反应，缺乏特异性。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体只能识别每个抗原的单个表位。单克隆抗体对靶点特异性高，非特异性交叉反应低，批次差异小。
“重组”一词是指利用合成基因在体外生产的抗体。与传统的单克隆和多克隆抗体相比，重组抗体可以提供长期和安全的供应，批次之间的差异很小。由于抗体的编码序列已知并确定，因此可以根据预期用途进一步设计和操作。
为保证实验的可重复性和抗体的长期供应，我们建议在有适合特定目标和应用的克隆时使用重组单克隆抗体。重组多克隆抗体可以为传统应用多克隆抗体提供理想的解决方案(如分析低丰度靶标或同时检测各种翻译后修改)。重组多克隆抗体是精心挑选的单克隆抗体混合物，旨在识别同一抗原上的不同表位。因此，只有重组抗体才能提供出色的灵敏度、特异性和再现性。
抗体特异性通过基因敲除验证确认
良好的抗体具有目标特异性，即使在低表达水平下也能识别出感兴趣的蛋白质。然而，许多研究表明，并非所有抗体都具有这种特异性，许多抗体会与非目标蛋白质发生交叉反应。
基因敲除(KO)验证是最公认、最可靠的抗体特异性验证方法之一。这种稳定的技术可以通过测试KO细胞系统、细胞裂解液或不表达目标蛋白质的组织来确认抗体的特异性。特异性抗体不应在KO细胞系统中产生信号，而应在野生细胞系统中产生特异性信号。这样，KO验证就成了真正的负对比。
下图14显示了免疫细胞化学(ICC)KO验证Ki-67抗体的实例，Ki-HAP1细胞(底部)没有Ki67(绿色)表示基因敲除。
图14. 免疫细胞化学/免疫荧光图像用于野生细胞(上)和Ki67基因敲除HAP1细胞(下)中Ki67抗体敲除。绿色是抗Ki67 (ab92742)和山羊抗兔IgG(Alexa Fluor® 488)红色是抗性的α-微管蛋白(Alexa Fluor® 594)蓝色是用DAPI标记的核DNA。
我们建议您选择经过多次应用验证的抗体，最好使用KO技术。或者您也可以使用适当的KO细胞系统、KO细胞裂解物或组织来验证抗体。
原始免疫信息
对宿主动物的免疫通常是从免疫原开始的。这些免疫原可以是全长蛋白质、多肽或整个细胞。
使用的免疫原将决定抗体和蛋白质的哪个区域。例如，如果你想通过FACS检测活细胞上的细胞表面蛋白，你应该选择蛋白质外结构区域的抗体。
样品处理
抗体对特定图像的表面具有特异性。由于样本处理会改变表面图像（例如，固定会导致蛋白质因甲醛诱导亚甲基桥而交联），一些抗体只对特定方法处理的样本有效。许多抗体只能识别还原和变性的蛋白质，因为它们可以显示被覆盖的表面。另一方面，一些抗体只能识别原始蛋白质的表面。
对于免疫组织，一些抗体只适用于未固定的冷冻组织。其他被福尔马林固定和石蜡包埋的抗体需要抗原回收步骤来暴露其表面位置。
宿主种类
如果打算用二抗进行间接检测，最好选择与样品不同物种的一抗。这样可以避免二抗(抗免疫球蛋白)与样品中的内源性免疫球蛋白的交叉反应。例如，如果你研究小鼠蛋白，你应该选择在小鼠以外的物种（如兔子）中培养的一种抗性。因为交叉反应是由样本中存在的宿主抗体引起的，所以这是组织样本的陷阱，但不是细胞系统。
假设您必须使用与组织样本具有相同宿主物种的抗性。在这种情况下，您需要仔细考虑如何修改方案以减少背景染色。或者，为了避免交叉反应，您可以使用由不同物种的结构区域组成的嵌合抗体。
不含任何内源性免疫球蛋白(IgG)当细胞裂解物用于Western印记等应用或使用一抗共轭直接检测实验时，您不必担心一抗宿主物种。
载体及防腐剂
抗体通常储存在磷酸盐缓冲盐水中(PBS)溶液中含有牛血清白蛋白(BSA)其他载体蛋白、甘油和氮化钠等防腐剂。虽然这些都是保持抗体稳定性和防止污染的重要组成部分，但它们会阻碍标签（如荧光染料、酶和金属）的有效连接，影响活细胞系统，甚至干扰高度专业的硬件设置。
在典型的共轭反应中，BSA将与一抗竞争吸附到相关标签上，从而大大降低了共轭效率。抗体溶液中的氮化钠会对细胞产生毒性，从而限制抗体在细胞培养中的使用，并对连接产生负面影响。因此，如果您计划使用一个共轭或一个抗染色活细胞，我们建议您选择不含载体或防腐剂的抗体配方。
参考文献
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