化学词典告诉你细胞冷冻的操作步骤和预防措施。细胞冷冻是一种将细胞放置在低温环境中以减少细胞代谢以便长期储存的技术。细胞冷冻是细胞保存的主要方法之一，在细胞保存中发挥着作用。
细胞冻结的操作步骤
(一)细胞冻存
1.准备10%DMSO或甘油～20%冷冻小牛血清培养液；
2.取对数生长期细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3.去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)消化单层生长的细胞；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量的冷冻培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞均匀，计数，将冷冻液中细胞的最终密度调整为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分成冷冻管，每管1～1.5 ml；
7.在冻存管上标明细胞名称、冻存时间和操作人员；
8.冷冻：冷却速率-1的标准冷冻程序～-2℃/ min；当温度低于-25℃时，可增加至-5℃～-10℃/min；当达到-100℃时，液氮可以迅速浸泡。也可以将装有细胞的冷冻储存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱过夜，取出冷冻管，移入液氮容器。
(二)细胞复苏
1.将冷冻管从液氮容器中取出，直接浸泡在37℃的温水中，不时摇动，使其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冷冻管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加入离心管，滴入培养液10倍以上，混合均匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调节细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.第二天更换培养液，继续培养。
细胞冻结的注意事项
1．以前的培养细胞从增殖期到形成致密的单层细胞都可以用于冻结，但最好是对数生长期细胞。最好在冻结前一天更换一次培养液；
2．将冷冻储管放入液氮容器或取出时，应做好防护工作，避免冻伤；
3．最好使用新准备的培养液进行冷冻和复苏。
