锌结合乙醇脱氢酶结构域蛋白1抗体的应用

2021年06月09日 阅读量:3
背景[1-3]

锌结合乙醇脱氢酶结构域蛋白1抗体是一类可以特异性结合锌结合乙醇脱氢酶结构域蛋白1的一类多克隆抗体,主要用于体外检测锌结合乙醇脱氢酶结构域蛋白1的免疫学实验。

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,简称ADH)的系统名为:乙醇:辅酶I氧化还原酶(alcohol:NAD+oxidoreductase),大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中,是一种含锌金属酶,具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶,催化伯醇和醛之间的可逆反应:CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+。在人和哺乳动物体内,乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系,参与体内乙醇代谢,是人和动物体磷酸钙内重要的代谢酶。作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶,它在很多生理过程中起着重要作用。它是一种广泛专一性的含锌金属酶。乙醇脱氢酶乙醇氧化体系是在肝脏中代谢酒精的一条主要途径。乙醇脱氢酶氧化体系包括醇脱氢酶(ADH)和醛脱氢酶(ALDH)。

锌结合乙醇脱氢酶结构域蛋白1免疫组化

乙醇脱氢酶活性中心由一个锌原子,His-67,Cys-174,Cys-46,Ser-48,His-51,Ile-269,Val-292,Ala-317和Phe-319构成。锌负责结合底物酒精。Cys-146,Cys-174和His-67结合锌,Phe-319,Ala-317,His-51,Ile-269和Val-292通过氢键与NAD+稳定结合。His-51和Ile-269与烟酰胺与核糖醇形成氢键结合。Phe-319,Ala-317和Val-292与NAD+上的氨基形成氢键。关于结构锌的位点,哺乳动物的乙醇脱氢酶也有结构锌位点。在这里锌离子对蛋白质结构稳定起到至关重要的作用。

应用[4][5] 用于拟南芥乙醇脱氢酶纯化及酶学性质研究

乙醇脱氢酶是许多有机体中主要短链醇代谢的关键酶。典型的乙醇脱氢酶是一个锌结合酶,以二聚体形式作用且依赖NAD(P)+辅助因子互变乙醇和乙醛。植物ADH的3个保守功能域分别为锌结合位点、Rossmann折叠NAD(P)+结合蛋白和具有GroES结构的ADHN结构域。

构建了拟南芥ADH蛋白的原核表达载体,纯化可溶性ADH蛋白并进行体外功能结构试验。

主要结果如下:1.成功构建得到的原核表达拟南芥ADH蛋白载体,以pET-HTT为表达载体,R二甲基硅油乳液osetta为宿主表达细菌,20℃条件下0.1%IPTG诱导15 h,纯化得到了高纯度的拟南芥ADH蛋白。

2.�利用全波长酶标仪测量反应产物NADH在340 nm的吸光度值的变化和生化反应动力学理论,得到了拟南芥ADH酶学性质,包括最适反应PH为10.5,具有广泛的底物选择性,最适反应底物为乙醇。

最大反应速率Vmax(NAD)为7.9�2.6 U/mg,Km(NAD)值为1.65�0.42 mM。3.根据序列对比和分子动力学分析的结果,发现乙醇脱氢酶两个结构域是由连接肽连接的,连接肽中的甘氨酸残基有可能对两个结构域的相对移动以及酶活力有重要作用,为验证猜想,构建了三个突变体载体并分别纯化其蛋白,通过比较野生型和突变体蛋白的酶活力,我们发现酶活力并没有发生显著变化。

参考文献

[1]Structural insight into the conformational change of alcohol dehydrogenase from Arabidopsis thaliana L.during coenzyme binding[J].FangFang Chen,Ping Wang,Yan An,JianQin Huang,YingWu Xu.Biochimie.2015

[2]Horse Liver Alcohol Dehydrogenase:New Perspectives for an Old Enzyme[J].Daniela Quaglia,Jane A.Irwin,Francesca Paradisi.Molecular Biotechnology.2012(3)

[3]Superfamilies SDR and MDR:From early ancestry to present forms.Emergence of three lines,a Zn-metalloenzyme,and distinct variabilities[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.2010(1)

[4]Alcohol dehydrogenase and its simple inorganic models[J].Anna Doga.Coordination Chemistry Reviews.2009(7)

[5]胡涛.拟南芥乙醇脱氢酶纯化及酶学性质研究[D].浙江农林大学,2015.

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